РИПЛ:: Медицинское оборудование :: Исследование последствий трансплантации стволовых в органоти
::РИПЛ::
 Технология фокальный нанонож при лечении рака предстательной железы
06 августа 2018 года
Подробное описание техники применения необратимой электропорации NanoKnife IRE для лечения рака простаты в клинике урологи Сеченовского Университета

 Праздник Первой Помощи в Сокольниках
21 июля 2018 года
В субботу, 21 июля, Компания АРИБРИС провела традиционный ежегодный Праздник Первой Помощи в парке «Сокольники»

 Параментский час.
15 июля 2018 года
Депутат Александр Гутенев предложил разместить дефибрилляторы в общественных местах. По его словам, они ежегодно могут спасать до 30 тысяч жизней.

 Применение Наноножа в лечении рака простаты
25 апреля 2018 года
Врачи сеченовского университета провели первые операции по фокальному лечению рака простаты с применением новой технологии NanoKnife. Операции проведены в рамках международного клинического исследования, аппаратура предоставлена нашей компанией.

 30-й Всемирный юбилейный Конгресс IASGO
09 сентября 2018 года
Международная ассоциация хирургов, гастроэнтерологов и онкологов IASGO проведет 30-й Всемирный Конгресс в гостинице "Украина" в Москве 9-12 сентября 2018 года. Компания РИПЛ планирует представить на выставке продукцию фирм AngioDynamics, ARGON и Tekno-Medical

 Праздник в Сокольниках!
15 июля 2017 года
Компания АРИБРИС провела 15 июля в парке «Сокольники» прекрасный, ставший уже традиционным, Праздник Первой Помощи

 
Новости Компания Оборудование Статьи Ссылки Контакты

Версия для печати

Главная / Медицинские Статьи для специалистов / / Исследование последствий трансплантации стволовых в органоти

Исследование последствий трансплантации стволовых в органотипическую культуру сетчатки глаза

Исследование последствий трансплантации нейральных стволовых/прогениторных клеток (НСПК) и мультипотентных клеток стромы костного мозга (ММСК) в органотипическую культуру сетчатки глаза, поврежденную инфракрасным лазерным излучением

Сергеев С.А.1, Семенова М.Л1, Сабурина И.Н.2, Кошелева Н.В.1,2
1МГУ им. М.В. Ломоносова биологический факультет, каф. эмбриологии
2НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН

Введение
Изменения в сетчатой оболочке глаза, вызванные разнообразными внешними повреждающими факторами, часто ведут к частичной или полной утрате зрения. Несмотря на различие этиологических факторов в основе развития целого ряда патологий сетчатки в большинстве случаев дисфункциональные изменения сетчатой оболочки сопровождаются разрушением клеточных взаимосвязей и гибелью нейронов, аналогичные процессы происходят и при старении организма. Функциональная реабилитация сетчатки при патологии различного генеза в настоящее время остается актуальной задачей. Для эффективного лечения патологических состояний сетчатки необходимо детальное рассмотрение процессов, вовлеченных в их возникновение и развитие, и процессов, приводящих к их репарации, то есть необходимо проведение большого числа экспериментов.
Для предотвращения развития необратимых нейродегенеративных процессов в сетчатке глаза применяют трансплантацию клеток с широкими потенциями к дифференцировке – стволовых/прогениторных элементов нервной ткани или клеток стромы костного мозга. Введенные в организм реципиента данные клетки не только активно мигрируют к месту повреждения и замещают своими дифференцированными потомками утраченные элементы дефектной ткани, но и секретируют целый спектр трофических и регуляторных факторов, поддерживающих функциональность поврежденной ткани и активирующих ее собственные системы репарации.
Наиболее перспективными клеточными популяциями, применяемыми для трансплантации при лечении дегенеративных процессов в сетчатой оболочке глаза, являются нейральные стволовые/прогениторные клетки (НСПК) и мультипотентные клетки стромы костного мозга (ММСК).
Применение НСПК в качестве материала для трансплантации обусловлено их нейрональным происхождением, то есть при введении в сетчатку данные клетки попадают в микроокружение, способствующее поддержанию их пролиферации и дифференцировки, получают возможность взаимодействовать с нейрональными клетками самой сетчатки и непосредственно участвовать в замещении утраченных в результате повреждения элементов сетчатой оболочки глаза. Многолетний успешный опыт использования НСПК для терапии нейродегенеративных заболеваний позволяет говорить о перспективности применения данной клеточной популяции и в офтальмологии.
Однако процедура выделения НСПК достаточно трудоемка и требует привлечения как источника эмбрионального материала, что приводит к возникновению морально-этических проблем, к трудностям получения материала в короткие сроки и невозможности получения аллогенных для пациента клеток. В последние годы накоплен значительный материал по возможности дифференцировки других мультипотентных клеток взрослого организма в нейрональном направлении, в частности по трансдиффернцировке клеток стромы костного мозга – ММСК.
В ряде работ по трансплантации клеток костного мозга in vivo в глаз грызунов отмечается морфологическое  и биохимическое преобразование ММСК не только в нейроны, но и в терминальнодифференцированные фотореципторные клетки. Вместе с этим костный мозг представляет собой сравнительно легкодоступный материал для выделения аллогенных мультипотентных клеток, использование которого позволяет избежать многих проблем, присутствующих при применении НСПК. Однако вопрос о функциональном замещении нервных клеток трансдифференцированными ММСК и их потомками остается открытым. Наблюдаемый положительный клинический эффект после трансплантации ММСК в нейрональные структуры в первую очередь обусловлен коктейлем факторов, секретируемых инъецированными клетками, способных к активации собственных репаративных процессов реципиентной ткани. Поэтому целесообразность применения клеток костного мозга в качестве материала для трансплантации при лечении дегенеративных процессов в нейросетчатке требует дальнейшего исследования и разработки новых модельных систем, позволяющих получать информацию на протяжении всего времени эксперимента от отдельных трансплантированных клеток.
Несмотря на дифференцировку вводимых клеток в нейрональном направлении сохранность клеток донора длительное время в сетчатке эффективное функциональное восстановление комплексной структуры сетчатки глаза возможно лишь при образовании адекватных взаимосвязей между клетками. К сожалению, накопленный к настоящему времени теоретический и практический материал в области биологии стволовых клеток не позволяет достоверно прогнозировать эффективность терапии при помощи клеточной трансплантации. Мы все еще далеки от полного понимания тех механизмов, которые запускают восстановление ткани реципиента при введении клеток, и в настоящее время не представляется возможным этот процесс контролировать.
В связи с этим целесообразно создание адекватных модельных систем, максимально приближенных к условиям in vivo, которые позволят не только с легкостью детектировать процессы клеточной миграции, дифференцировки и гибели клеток на любых сроках после трансплантации, но и вносить коррективы в поведение трансплантируемых клеток. Одной из таких моделей является органотипическая эксплантационная культура сетчатки глаза крысы. При данном типе культивирования удается получить образцы практически нативной ткани, длительное время сохраняющие исходную цитоархетиктонику и клеточный состав in vitro.
Наиболее удачной экспериментальной моделью повреждения сетчатки глаза следует признать индуцированное лазером повреждение клеток. Данный подход позволяет наносить локальные повреждения заданной интенсивности, то есть получать воспроизводимые результаты во всей серии экспериментов. Кроме того, широкое применение лазерной аппаратуры в повседневной жизни существенно увеличивает шансы травмирования сетчатки ее излучением, что делает данную модель наиболее актуальной.
Лазерное излучение – разновидность неионизирующего электромагнитного излучения, характеризующегося монохроматичностью, когерентностью, поляризованностью, изотропностью, способное оказывать дозозависимый эффект на биологические ткани. Проходя через биологический объект, энергия излучения частично рассеивается в виде тепла, частично передается окружающим молекулам, вызывая их активацию с последующим переизлучением энергии и ее тепловой диссипацией. Существуют три основных типа повреждения тканей, вызванных лазерным облучением. Это тепловые эффекты, фотохимическое воздействие, а также акустические переходные эффекты. В зависимости от интенсивности воздействия и времени экспозиции эффект облучения лазером может быть как положительным, стимулирующим пролиферативную активность клеток, так и отрицательным, приводящим к гибели клеток, их разрушению, коагуляции тканей и испарению органических веществ.
Ввиду возможности независимо контролировать различные параметры лазерного излучения, его применение в экспериментальных работах по моделированию повреждения нейрональных сетей представляется чрезвычайно перспективным и удобным.
 

Методика
Получение культур сетчатки
Для получения эксплантационной культуры сетчатки глаза использовали 4-х дневных самцов крыс Wistar. Сетчатку выделяли непосредственно после декапитации животных при помощи микроинструментов из энуклеированых глаз, обработанных 70% этанолом для дезинфекции в течение 5-10 мин. Глазное яблоко промывали раствором Хэнкса (НПП ПанЭко, Р020). Вскрытие глазного яблока проводилось по модицированному протоколу Kretc et al., 2007. по следующей схеме:
энуклеированный глаз в бессывороточной среде DMEM вскрывали скальпелем и микроножницами удаляли роговицу; пинцетом удаляли хрусталик и радужку; движениями пинцетов в трех плоскостях, при фиксации глазного нерва, изымали стекловидное тело и отслаивали сетчатку от подлежащего пигментного эпителия.
 Непосредственно после выделения сетчатку немедленно помещали на поверхность чашек Петри (Falcon 35 мм) в небольшое количество культуральной среды слоем фоторецепторов, обращенным наружу. Полученные таким образом эксплантаты нейросетчатки культивировали в стандартных условиях (+37˚С, 5% СО2, 98% влажности) в течение 30 дней в среде DMEM/F12 (НПП ПанЭко), содержащей глутамин и инсулин-трансферин-селенит (ITC) 1:50, с добавлением сыворотки FCS 7% (HyClone), факторов роста bFGF 10 нг/мл (Sigma) и EGF 10 нг/мл (Sigma), гепарина, добавок N2 supplement 100:1 и B27 50:1 и антибиотиков (гентамицин 5мкл на 1мл и Pen-strep 1% (Sigma)).Смену среды проводили каждые 2-3-е суток.
Нанесение повреждения
В качестве повреждающего фактора использовали инфракрасный лазер (1480 nm) Zilos-tk (Hamilton Thorne) миллисекундного диапазона мощностью 300 mW, нагревающий поверхность в фокусе до 1500С приводивший к клеточной деградации и коагуляции ткани. Для повреждения выбирали квадрат со стороной 100 мкм средней области разрастания края эксплантата сетчатки. Повреждение сетчатки проводили 15-ю импульсами лазера длительностью 1000-3000 мс на 14 сутки культивирвоания эксплантатов сетчатки.
Трансплантация клеток
В культуры сетчатки инъецировали ксеногенные клетки мышей линии С57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)/Osb/J, имеющие устойчивую экспрессию EGFP. Для опыта использовали нейральные стволовые/прогениторные клетки субвентрикулярной зоны 12 дневных плодов – НСПК 2-го пассажа и клетки стромы костного мозга из большеберцовых и бедренных костей новорожденных мышат- ММСК 2-6-го пассажа, выделенные по протоколу Schrepfer et al., 2007. Инъекцию клеток проводили стеклянным микрокапилляром под бинокуляром Olympus CZX 20 c цифровой камерой DP50 при помощи микроинъекционной приставки в зону разрастания клеток эксплантата в объеме культуральной среды 0.1 мкл на расстояниях 100 мкм, 1000 мкм и 3000 мкм от зоны повреждения.
Оценка результатов
После трансплантации производили прижизненные наблюдения за миграцией и морфологическими изменениями инъецированных клеток на различных сроках культивирования, оценивали поведение клеток при различных способах инъекции (внутрь эксплантата и при нанесении на его поверхность), сравнивали результаты трансплантации клеточной суспензии различной плотности (от единичных клеток до 500 клеток) и агрегатов клеток, полученных методом культивирования в висячих каплях (HD – культивирование), при выведении эксплантатов из эксперимента проводили иммуногистохимический анализ дифференцировки трансплантированных клеток на маркеры нейрональной и глиальной дифференцировки (β-III-тубулин и GFAP соответственно), а так же на маркер клеток эндотелия капилляров GSL-IB4, на различных сроках культивирования оценивали жизнеспособность трансплантата по включению мертвыми клетками йодида пропидия (PI).
В работе использовали первичные антитела:  anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) (Sigma G9269);, Griffonia simplicifolia IB4 isolectin (GSL-IB4) (Sigma L1509)и mouse anti-tubulin, betta III isoform monoclonal antibody (Chemicon, MAB1637). На следующий день проводилась окраска вторичными антителами Texas read, Cy2.
Получение изображений
Получение прижизненных фотографий клеток и флуоресцентных изображений проводили под инвертированным флуоресцентным микроскопом Axsiovert 25 с цветной камерой DP 500 и конфокальным микроскопом Axsiovert 200LSM 510Meta Carl Zeiss.

Результаты и обсуждение
Первым этапом данного исследования было получение долгосрочно переживаемых in vitro органотипических эксплантационных культур сетчатки глаза новорожденных крысят. В ходе наблюдений за культивируемыми образцами было отмечено, что на протяжении всего времени эксперимента (около 30 суток) имелась хорошая сохранность цитоархитектоники ткани и в ее составе присутствовали основные клеточные типы, характерные для интактной сетчатки in vivo. То есть была сформирована адекватная модель развивающейся нейросетчатки, позволяющая поддерживать микроокружение нервных клеток и использовать разнообразные методы воздействия на ткань.
На протяжении всего времени культивирования проводили ежесуточные наблюдения изменения морфологии эксплантатов сетчатки и расселяющихся из него клеток. Было показано, что с увеличением времени, прошедшим после постановки культуры, клетки края эксплантата прикреплялись к субстрату и интенсивно мигрировали по дну культуральной чашки, что приводило к формированию зон расселения клеток эксплантата и его расползанию. Необходимо отметить, что клетки, составляющие исходную массу эксплантата, имели различные адгеззивные способности по отношению к пластику чашки и значительно отличались по скорости и дальности миграции. Так первые ламеллоподиальные выросты, заякоривающие эксплантат на поверхности пластика, образовывали глиальные клетки. Данные отростки клеток глии появлялись, начиная со вторых суток культивирования, и интенсивно разрастаясь в последующие, формировали подложку для миграции нейрональный клеток. Распространение тел нейронов происходило исключительно по глиальным и эндотелиальным элементам. Миграция нейрональных клеток происходила за счет выпускания и последующего сокращения их ассинаптических дендритов по механизму, детально описываемому Сотниковым. Однако отростки, выпускаемые нервными клетками в первые сутки начала разрастания края эксплантата (14 сутки культивирования), в своем росте существенно обгоняли выселяющиеся глиальные и эндотелиальные клетки. Так же как и в работах других авторов, отмечено распространение клеток глии преимущественно вдоль длинных нейритов, выходящих за пределы зоны разрастания эксплантата на расстояние 30 -100 мкм.
К 14 дню нахождения в культуре становились четко различимы области выселения клеток – зоны разрастания края эксплантата, которые по морфологическим признакам подразделялись на ближнюю, среднюю и дальнюю по отношению к исходной границе кусочка сетчатки. Для ближней зоны была характерна значительная толщина слоев выселяющихся клеток, что делало ее неудобной для последующего анализа результатов эксперимента. В дальней зоне клетки находились в состоянии монослойной культуры, что нивелировало преимущества органотипического культивирования. Поэтому для реализации наших экспериментальных задач была выбрана средняя зона края разрастания эксплантата, содержащая большое количество клеток, сохраняющих взаимосвязь друг с другом.
Выселившиеся за пределы эксплантата нейрональные клетки образовывали коммуникаторные взаимосвязи, наблюдалась их самоорганизация de novo в сеть типа диффузного нервного плексуса с отдельными микроганглиями нейронов из 3-х – 5-и клеток. Наиболее наглядно такие примитивные нервные сети удалось продемонстрировать на периферии зоны разрастания, что позволяет предположить их присутствие и в средней ее части. Данные иммуногистохимического исследования на маркеры нейрональной – β-III-тубулин и глиальной – GFAP дифференцировки позволили подтвердить данное предположение (Рис.1.).
При нанесении повреждения лазерным импульсом наблюдалось отчетливое изменение макроструктуры ткани в области фокуса луча, сопровождающееся потемнением цитоплазмы клеток, их интенсивной вакуоляризацией и коагуляцией межклеточного матрикса. Последняя отчетливо проявлялась через несколько часов после нанесения повреждения и приводила к формированию четко очерченной зоны деградации (Рис.2.). Клетки дальней зоны расселения, подвергшиеся воздействию лазера, быстро укорачивали свои отростки, ошаривались и откреплялись от подложки. Аналогичное открепление клеток эксплантата от культурального пластика было характерно и для средней зоны расселения и приводило к флотированию краев эксплантата. Кроме того, наблюдался отсроченный эффект лазерного облучения в виде массовой клеточной гибели в эксплантате сетчатки на 2-3-е сутки после травмы.
Таким образом, нанесенное повреждение с помощью лазера являлось легко визуализируемым с применением модуляционного контраста Хоффмана, проявлялось в существенной реорганизации межклеточного матрикса (коагуляции), приводило к утрате клеточных взаимосвязей и изменению морфологии клеток, завершающихся их гибелью, и носило необратимый характер.
При анализе клеточной гибели по включению йодида пропидия в области повреждения лазером было показано реальное губительное действие лазера на область, превышающую визуализируемую в проходящем свете в 2-3 раза.
Для моделирования процессов восстановления поврежденной области был применен метод трансплантации клеток in vitro. После повреждения эксплантата сетчатки лазером в его среднюю зону расселения инъецировали НСПК и ММСК GFP+ мышей. Было выбрано несколько сроков введения стволовых/прогениторных клеток: 1) непосредственно после нанесения травмы, 2) через сутки, 3) через трое суток и 4) через семь суток после воздействия лазера. Так же в описанных сериях экспериментов варьировало расстояние от области повреждения до места инъекции, оно составляло 100 мкм, 500 мкм, 1000 мкм, 3000 мкм. Варьировал и способ введения клеток: в одном случае это инъекция вглубь нейросетчатки, в другом – нанесение на ее фоторецепторную поверхность. Таким образом, удалось проследить судьбу двух наиболее перспективных в клиническом отношении различных клеточных популяций (НСПК и ММСК) в составе трехмерной культуры сетчатки после повреждения лазером в зависимости от сроков и дальности инъекции от места локализации повреждения.
Оказавшись в новом микроокружении, трансплантированные клетки активном мигрировали  и изменяли свою морфологию, выпуская длинные ветвящиеся отростки, приобретали фенотип, характерный для нейронов. При сравнении полученных изображений распределения флуоресцентных клеток было установлено, что наиболее активная миграция клеток происходит по направлению от места трансплантации к области повреждения (Рис.3.А-В). Сравнительный анализ зависимости количества активно передвигающихся клеток на различных сроках введения показал, что трансплантации непосредственно после нанесения травмы и через сутки характеризуются наибольшей миграционной активностью клеток. В то время как при трансплантации спустя 7 суток после воздействия лазера интенсивность миграции инъецированных клеток практически не отличалась от контрольных образцов, подвергнутых трансплантации без травмы.
Цейтраферная конфокальная съемка и ежедневные наблюдения за культурами показали, что наиболее активно миграция трансплантированных клеток происходила в первые 24 часа и значительно снижалась с их дифференцировкой на третьи сутки после инъекции. Распространение инъецированных клеток в эксплантате, поврежденным лазером, происходило на расстояния, превышающие 5 мм от места трансплантации вдоль вектора, направленного к области травмы и достигало 1 мм в противоположном направлении (Рис.3. С-D).
На 7-е сутки после трансплантации было проанализировано распределение GFP+ клеток относительно зоны поражения и зоны инъекции по вектору их миграции. Показано, что до 3-х суток после трансплантации, инъецированные клетки активно мигрировали на большое расстояние, превышающие 1000 мкм, от места введения, причем данное перемещение клеток имело выраженную направленность к месту повреждения. Статистическая обработка результатов подсчета GFP+ НСПК в одном поле зрения в зоне повреждения и на таком же расстоянии по вектору, проходящему через место инъекции по критерию Манна-Уитни, показала достоверное отличие (p<0,01) в количестве донорских клеток, присутствующих в этих областях (Рис.4). В контрольных эксплантатах, подвергшихся клеточной трансплантации без лазерного повреждения, распространение инъецированных клеток было однородным по всем направлениям с превалированием миграции от центра эксплантата по миграционным путям выселяющихся из него клеток. Таким образом, показана неоднородность распределения трансплантированных НСПК относительно места введения при нанесении повреждения лазером, то есть наличие направленного таксиса к зоне дефекта.
Мигрирующие НСПК перемещались за счет образования длинных филлоподиальных выростов, простиравшихся к области повреждения, по которым происходило перемещение ядросодержащей части клетки их образовавшей, и других клеток, располагающихся по соседству. В некоторых случаях такие выросты самоорганизовывались в фибриллярные тяжи, вдоль которых проходила коллективная миграция клеток, образуя миграционную дорожку.
При достижении зоны повреждения наблюдалась остановка миграции клеток, отмечено образование ими ассинаптических дендритов, распространяющихся во всех плоскостях, и агрегация трансплантированных клеток друг с другом. Пришедшие в поврежденную область клетки оставались в ней на протяжении всего времени эксперимента и полностью утрачивали миграционную активность, образуя густую сеть нейритов.
Первые клетки, пришедшие в зону воздействия лазера, детектировали спустя 1 час после трансплантации при введении их на расстоянии 100 мкм, через 12 часов при инъекции на удалении в 500 мкм и через 3-5 суток при дальних областях трансплантации (>1000 мкм). Наиболее активное привлечение клеток в поврежденную область происходило на протяжении первых 3-х суток после создания дефекта сетчатки и резко угасало в последующие.
Существенное влияние на поведение трансплантированных клеток оказывала их концентрация при трансплантации. Так введение в эксплантат единичных клеток приводило к быстрой остановке их передвижения внутри сетчатки, сопровождающееся слабой морфологической дифференцировкой. Единичные НСПК приобретали глиальный фенотип начиная с 5-х суток после трансплантации. Единичные ММСК вообще не сохранялись дольше суток в эксплантате. При трансплантации небольшого количества клеток (50-100) их миграционная активность так же была подавлена, клетки образовывали ассоциаты и их таксис был направлен друг к другу, лишь единичные клетки мигрировали на значительные расстояния. Совершенно иная картина наблюдалась при трансплантации клеток в количестве >1000: большинство клеток активно перемещалось к области повреждения, мигрирующие клетки образовывали длинные нейриты, служащие для перемещения других клеток, быстрее происходила дифференцировка НСПК с преобладанием нейрональной составляющей. В составе эксплантата, инъецированные клетки не только сохраняли жизнеспособность на протяжении более 2-х месяцев, но и активно пролиферировали.
При исследовании распределения трансплантированных НСПК в эксплантате с несколькими зонами лазерного повреждения, находящимися на различном расстоянии от места инъекции (600 мкм, 1000 мкм, 3000 мкм), было показано заселение трансплантированными клетками всех зон повреждения через 7 суток после инъекции (Рис.5). Однако было отмечено уменьшение количества клеток в зонах повреждения, по мере их удаления от области введения. При удалении зоны повреждения от зоны введения клеток на 1000 мкм клеточная популяция, детектируемая в поле зрения, включающего поврежденный лазером участок, составляла 56% от количества клеток зоны, удаленной на 600 мкм и 27% в зоне, удаленной на 3000 мкм от места трансплантации.
При трансплантации ММСК в органотипическую культуру сетчатки после повреждения лазером наблюдалась их сохранность в составе эксплантата в течение 30 суток при инъекции более 500 клеток. При введении единичных клеток их не удавалось зарегистрировать спустя трое суток после трансплантации.
В работе было применено 2 метода внесения ММСК в культуру сетчатки: непосредственная инъекция вглубь средней зоны края разрастания эксплантата и поверхностное нанесение клеток. В случае первого ММСК непосредственно контактировали с нейрональной составляющей сетчатой оболочки глаза, второй имитировал супрахороидальную инъекцию ММСК in vivo. Для обоих методов внесения ММСК была показана быстрая миграция отдельных клеток небольшого диаметра (10-15 мкм), образование ими длинных нейритоподобных выростов и ламелоподий. То есть происходила морфологическая дифференцировка трансплантируемых клеток согласно их новому микроокружению с приобретением ими фенотипа нейральных клеток (Рис.6). Для трансплантированных ММСК было отмечено образование двух характерных фенотипов: нейронального с длинными тонкими ветвящимися отростками, имеющими ампулярные расширения c оформленным компактным телом клетки и глиального с ламелоподиальными выростами цитоплазмы и крупным ядром с хорошо различимыми ядрышками (Рис.5). Нейритоподобные выросты ММСК проникали вглубь эксплантата сетчатки, образовывали анастомозы и контактировали с другими трансплантированными клетками и нейронами самого эксплантата. То есть трансплантированные ММСК имели сходное поведение с инъецированными НСПК, попадая в нейрональное микроокружение нейросетчатки.
Однако в отличие от НСПК способ введения ММСК не влиял на активность миграции трансплантируемых клеток. Как при нанесении на поверхность, так и при инъекции вглубь эксплантата, ММСК мигрировали по всем направлениям от места введения в течение первых суток. С началом дифференцировки клеток их миграция останавливалась, что позволяет говорить о важности первых часов после трансплантации для миграции введенных клеток, занятии ими новых ниш, пролиферации и дифференцировки с последующей возможностью репарации деффектов.
При трансплантации ММСК движение клеток не было аттрагировано к области травмы сетчатки. В то же время, при нанесении повреждения эксплантату, ММСК быстрее изменяли свою морфологию по сравнению с введенными клетками в контрольные образцы, не подверженные воздействию лазера. В данной серии экспериментов морфологические изменения ММСК детектировали спустя 24 часа после инъекции, в то время как в контроле лишь через трое суток. Эти данные позволяют сделать предположение, что для морфологической дифференцировки трансплантированных клеток, отвечающей условиям их нового микроокружения, чрезвычайно важны регуляторные факторы, высвобождающиеся при гибели клеток в районе нанесения повреждения.

Заключение
Таким образом, в работе была продемонстрирована возможность моделирования in vitro процессов, происходящих в сетчатой оболочке глаза, поврежденной лазером, после трансплантации мультипотентных клеток НСПК и ММСК. Отмечено удобство использования лазера Zilos–tk как стандартизированного повреждающего фактора, позволяющего точно рассчитывать интенсивность воздействия на ткань.
Разработана и применена методика введения GFP+ клеток в органотипическую культуру сетчатки, позволяющая выявить различия в поведении и выживаемости трансплантированных НСПК и ММСК в составе эксплантата. При помощи лазерной сканирующей конфокальной микроскопии показана быстрая миграция трансплантированных НСПК и ММСК к очагу повреждения и их последующая дифференцировка в клетки с нейрональным и глиальным фенотипом, установление межклеточных взаимосвязей, то есть адекватная заместительная репарация дефекта нейросетчатки введенными клетками.
Отмечено различное поведение трансплантированных клеток в зависимости от их концентрации (которая для лучшей выживаемости трансплантата должна превышать 500), и от способа введения в культуру сетчатки (инъекция вглубь слоев оптимальна для выживания и миграции НСПК, в то время как из всех вводимых ММСК, как при нанесении на поверхность эксплантата, так и при инъекции, сохранялись и дифференцировались лишь отдельные клетки).
В результате полученных данных удается сделать предположение, что для наиболее эффективного восстановления повреждения сетчатой оболочки глаза при помощи клеточной трансплантации оптимальными являются НСПК, вводимые непосредственно в состав нейросетчатки, их приближенной легко доступной альтернативой можно считать ММСК, способные запускать и поддерживать репарационные процесс в ткани реципиента, а так же вставать на путь нейральной дифференцировки. Однако вопрос о функциональном замещении утраченных нервных клеток трансплантированными ММСК и их потомками все еще остается открытым.

Switch to English

: Поиск :

по сайту
по магазину

: ООО Рипл :

  125130 Россия, Москва,
  Старопетровский
  проезд, д.7а, стр.3,
  3-й подъезд, 3-й этаж

Телефон:
  (495) 258 25 24
 
Факс:
  (495) 648 03 63
 

Вакансии:


Разработано ООО «ЦЭТИС»

© 2004 - 2016 Компания "РИПЛ". Все права защищены. Тел.: +7(495)258 2524